Мурована п'ятиверха церква стоїть в історичному середмісті (вул. Спаська, 2), на території Державного історико-культурного заповідника, посідаючи острівне становище посеред кварталу, виходячи східним фасадом на пл. Рудченка. Масивний об'єм храму зіграв важливу роль у завершенні формування ансамблю містобудівних домінант історичного середмістя Глухова. Після знищення в 1962 р. головного в місті Троїцького собору Трьох-Анастасіївська церква залишилася наймасивнішою архітектурною домінантою середмістя, добре візуально сприймаючись як у внутрішньо міських просторах, з вулиць і площ, так і в зовнішніх панорамах, з заплави р. Есмань.

Пам'ятка поставлена на захід від Спасо-Преображенської церкви, поблизу неї. З багатьох видових точок вони сприймаються разом, формуючи гостро характерний комплекс пам'яток різних епох і стилів. Трьох-Анастасіївська церква в об'ємно-просторовій композиції Глухова є поєднувальною ланкою між домінантами двох головних майданів - Миколаївською церквою на Соборному майдані та Спасо-Преображенською церквою на колишньому Торговому майдані. Розташування пам'ятки збоку від цих майданів, при тому, що її добре видно з обох завдяки невисокій двоповерховій забудові, - це данина традиціям до класицистичного містобудування, з властивою йому вільною постановкою архітектурних домінант у розпланувальній структурі, переважанням бічних точок зору, з яких повніше розкривається образ будівлі, явним не сприйняттям суто фронтальних і вісьових перспектив.

Вперше Трьох-Анастасіївську муровану церкву було споруджено в південно-східному куті загальноміської фортеці на місці погорілої дерев'яної Воскресенської церкви у 1717 р. коштом гетьманші Анастасії Марківни Скоропадської за зразком Іллінської церкви - усипальниці Богдана Хмельницького в Суботові. Тридільний, без банний, зального типу храм з гранчастою апсидою і дзвіницею над західним притвором став домовим при гетьманській резиденції, яка з 1710 р. розташувалася в цьому кварталі. Церква потерпіла від пожеж 1748 та 1784 рр. Після останньої відбудована аж 1816 р. і набула класицистичних рис: над навою з'явилися декоративна сферична баня без під банника, прибудовано колонні портики, нову двоярусну дзвіницю над південно-західним кутом. Загалом, будівля була невеличкою і не відігравала помітної композиційної ролі в забудові середмістя.

У першій третині XIX ст. парафію Трьох-Анастасіївської церкви, як найбіднішу в місті, приєднали до Троїцького собору, а церкву фактично закрили. У 1846 р. глухівський купець Артем Якович Терещенко вніс на утримання храму 4 тисячі рублів і служба в ньому відновилася, а доброчинця обрали церковним старостою. Коштом А.Я.Терещенка у 1861 р. на другому ярусі храму влаштовано додатковий вівтар Воскресіння Христового, а в 1872 р. прибудовано бічний вівтар св. мученика Артемія.

1884 р. чернігівське губернське правління затвердило проект нової Трьох-Анастасіївської церкви, автором якого був відомий академік архітектури з Санкт-Петербурга Андрій Леонтійович Гун (1841-1920). Нова церква будувалася з 1885 р. поряд зі старою коштом глухівських промисловців братів Миколи і Федора Терещенків. Микола Артемович подарував під храм велику ділянку власної землі, а Федір Артемович 1889 р. пожертвував 60 тисяч рублів золотом. Завдяки клопотам меценатів церкву збудовано досить швидко й освячено 1893 р. Загальна вартість будівництва склала 387 221 рубель і 33 копійки. А 21 травня 1894 року брати Терещенки звернулися до Святійшого Синоду з проханням дозволити знести стару гетьманську церкву "как оставшуюся вследствие своей ветхости без всякого употребления".

Щоб визначити подальшу долю історичної будівлі з Києва відрядили професорів Київської духовної академії, відомих істориків Петра Лашкарьова і Миколу Івановича Петрова. Вони дійшли висновку, що "предназначенная к упразднению старая Трех-Анастасьевская церковь со стороньї зодчества не представляет собой ничего особенно замечательного, и кроме сохранившихся известий о первоначальной постройке зтой церкви женою гетмана Скоропадского Анастасиею, с зданием зтой церкви соединяются только воспоминания об опустошительньїх пожарах в Глухове". Аналогічні висновки дала Імператорська археологічна комісія. Звісно, з теперішніх позицій такі висновки видаються некоректними, але в ті часи критерії поцінування пам'яток були іншими, ніж тепер. Тож 2 січня 1895 р. вийшов відповідний указ Святійшого Синоду. Стару церкву розібрали протягом 1895-1897 рр. і потім на її місці довго стояла каплиця, збудована коштом братів Терещенків в еклектичних архітектурних формах, близьких до українського модерну, аж поки комуністи десь у 1950-х рр. не розвалили і її.

Протягом 1941-1943 рр. унаслідок бойових дій центральна баня храму була зруйнована, її відбудували по війні в трохи змінених формах - висоту підбанника дещо зменшили, а первісний еліпсоїдний купол замінили сплющеним сферичним. Пам'ятка використовується за прямим призначенням. У 1983 р. її ремонтували. До ремонту центральну баню вінчав первісний "розквітлий хрест", виконаний за кресленикам автора храму А.Л.Гуна для одного з бічних верхів. 1983 р. усі хрести замінили новими, що за формою не відповідають православним - це католицькі так звані кардинальські хрести.

Трьох-Анастасіївська церква вирішена в архітектурних формах неовізантійського стилю, що дещо нагадують форми Володимирського собору в Києві. Вона кубічна, п'ятиверха, тринавова, чотиристовпна, хрестовокупольна, з трьома гранчастими зовні й циліндричними всередині апсидами. Під всією церквою є невисокий нижній поверх, перекритий системою хрестових склепінь. Тут містився невеликий теплий храм, а також технічні пристрої парового опалення всієї будівлі. Тут же були передбачені місця для поховань фундаторів і членів їхньої родини.

Крипта під теплою церквою є місцем поховання провідних членів родини Терещенків: Ар-тем Якович, похований 1877 р., а також його дружина Єфросинія Григорівна (уроджена Стеслявська); Федір Артемович похований 1894 р.; Микола Артемович похований 1903 р. За радянської влади поховальний склеп був пограбований, а могильні плити - розбиті. Нині поховання упорядковані й заново освячені.

Зовні наявність нижнього поверху виявлена високим розвиненим цоколем з прямокутними вікнами, через які східні дільниці були забезпечені денним світлом. Розпланувально-просторова структура верхнього храму досить традиційна: чотири пілони за допомогою півциркульних під пружних арок, плоских пандативів та невеликих перехідних елементів у вигляді горизонтальних трикутників несуть масивний 12-віконний світловий підбанник, завершений сферичною банею. Рамена просторового хреста перекриті циліндричними склепіннями, приміщення у міжраменнях - хрестовими. Над ними поставлені наскрізні аркові восьмерики, увінчані куполами. Вони виконують функції дзвіниць і разом з центральною банею створюють враження п'ятибанного храму. Нетрадиційним моментом у розпланувально-просторовій структурі будівлі є наявність обходу (деамбулаторія) навколо середньої апсиди, а також ізольованість від основного простору храмового інтер'єра північно-західної та південно-західної дільниць, що створює хрещато-центричний внутрішній простір. У першій з цих ізольованих дільниць містяться сходи на дзвіницю, у другій - хрещальня. Обабіч середньої апсиди є кручені сходи, що ведуть на дві східні дзвіниці.

У вирішенні фасадів домінують вертикальні членування - лопатки, вузькі витягнуті вікна, півколонки, вертикальні профільовані гурти. Три входи акцентовані тамбурами-ганками з романо-візантійськими перспективними порталами й трикутними щипцями. Головний просторовий хрест виявлений на всіх фасадах пологими закомарами, що вінчають середні прясла стін, а також арковими вікнами, згрупованими у вигляді трифоріїв. У бічних пряслах вікна менших розмірів, скомпоновані у вигляді біфоріїв. Вікна розділяють вертикальні імпости у вигляді вишуканих романо-візантійських півколонок з кубічними різьбленими капітелями.

Порівняння пам'ятки з її проектом дозволило виявити зміни, яких зазнав авторський задум на стадії будівництва: змінена форма деамбулаторія - він зроблений гранчастим; у верхньому ярусі храму з'явилися додаткові спарені вікна для освітлення приміщень у міжраменнях просторового хреста; значно спрощено декор шляхом вилучення запроектованих кам'яних різьблених вставок, орнаментальних смуг, розеток, орнаментованих віконних оправ тощо. Замість цього широко застосовано аркові гурти зі смугами поребрика й сухариків.

Церква відзначається пишнотою, вишуканістю й доброю збереженістю інтер'єрного декору. М.А.Терещенко, бажаючи прикрасити інтер'єр мальованнями, спершу звернувся до знаменитого російського художника Віктора Михайловича Васнєцова, котрий розмальовував Володимирський собор у Києві, проте той відмовився. Тож декоративні й сюжетні мальовання в інтер'єрі виконані в 1892-1893 рр. за особистою участю й під керівництвом художників Володимирського собору братів Олександра Олександровича та Павла Олександровича Сведомських. Разом з ними храм розмальовували Василь Верещагін і Федір Журавльов. Програма мальовань була закладена в архітектурному проекті А.Л.Гуна: рослинні орнаменти неовізантійської стилістики в підбаннику, на підпружних арках та пілонах; зоряне небо в бані, конхах, на циліндричних склепіннях головного просторового хреста; на пандативах - Євангелісти в круглих медальйонах; Євхаристія в середній апсиді; на стінах по периметру храму - зображення у повний зріст постатей мучеників і святих. А.Л.Гун запроектував також низьку передвівтарну перегорожу у візантійських формах, з дуже пишним орнаментом і восьмигранною сінню над царськими вратами.

Під час виконання мальовань їх програму дещо змінили. Так у консі середньої апсиди зобразили Богородицю з немовлям Христом в оточенні херувимів, у бані - Святу Трійцю, на пандативах - Євангелісти, закомпоновані в трикутних площинах, а не в медальйонах. Орнаменти виконані з домінуванням геометричних мотивів квадрата, кола, хреста, меандра. Високий рівень мистецької єдності надає інтер'єру наявність золотого тла у всіх орнаментах, а також у сюжетних й фігурних мальованнях (зірки, німби, бліки тощо). У кольоровій гамі інтер'єру домінують насичені темно-сині, зелені, вохристі барви. За стилістикою всі ці мальовання тяжіють до мальовань Володимирського собору в Києві, виконаних у ті ж часи під керівництвом В.М.Васнєцова та А.В.Прахова. Мальовання у бані датується 1950-и рр.

Передвівтарна перегорожа з сірого полірованого мармуру виконана за проектом київського іконописця Олександра Івановича Мурашка, родинно пов'язаного з Глуховом. Вона вища й більша за масштабом ніж та, яку запроектував А.Л.Гун, зі скромнішим декором і трилопатевим завершенням кожного прясла. Тут є тільки ряд намісних ікон. В інтер'єрі збереглися також мармурові та дерев'яні різьблені кіоти. На східній підпружній арці на довгому ланцюгу підвішено триярусне бронзове панікадило тонкої мистецької роботи.

Будівля зведена з місцевої цегли на вапняно-піщаному розчині. Підмурки цегляні, заглиблені на 4 м від денної поверхні. Стіни потиньковані, зовні мають світло-сіре пофарбування. Вхідні двері дерев'яні, різьблені. Підлоги з квадратових плит сірого мармуру, дахи й бані по дерев'яних кроквах і кружалах укриті покрівельною сталю.

Трьох-Анастасіївська церква є визначною комплексною пам'яткою архітектури й монументального мистецтва доби історизму, місцем поховання видатних історичних діячів родини Терещенків. З 1979 р. є пам'яткою архітектури (нині - національного значення) під охоронним № 1537.